Пептидной структуры

с. 1 с. 2 с. 3 с. 4



На правах рукописи
ЛАВРОВ

Никанор Васильевич


ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭМОЦИОГЕННЫХ

И НЕЙРОПРОТЕКТИВНЫХ ЭФФЕКТОВ НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ

ПЕПТИДНОЙ СТРУКТУРЫ

14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология

03.03.01 – физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург
2013

Работа выполнена в Федеральном государственном казённом военном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова» МО РФ



Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Шабанов Петр Дмитриевич,

доктор медицинских наук профессор Русановский Владимир Васильевич
Официальные оппоненты:

Дьячук Георгий Иванович, доктор медицинских наук, профессор,

ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет

им. И.И. Мечникова» МЗ РФ, заведующий кафедрой фармакологии
Соллертинская Татьяна Николаевна, доктор медицинских наук, профессор,

ФГБУН «Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова» РАН, ведущий научный сотрудник


Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова» МЗ РФ


Защита состоится 21 мая 2013 года в 13-00 часов на заседании совета Д 215.002.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций на базе ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова» МО РФ (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Лебедева, д. 6).
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова» МО РФ.

Автореферат разослан «___» апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор Богомолов Борис Николаевич



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования

При исследовании пептидных препаратов было установлено наличие у них нейропротективного действия (Шабанов П.Д., 2008, 2012). Данные, полученные при изучении физиологического значения нейрональных факторов роста (Одинак М.М., Цыган Н.В., 2005), способствовали формированию концепции нейропротекции. В широком смысле термин «нейропротекция» обозначает сопротивляемость нервной ткани (мозга в первую очередь) той деструкции, которая провоцируется воздействием вредных факторов внешней и внутренней среды (интоксикации, инфекции, травмы, ишемии и т.д.).

В качестве перспективных нейропротекторов могут рассматриваться метаболические активаторы мозга и пептидные препараты. Синтетические препараты метаболического типа действия прочно вошли в современную фармакологию. Часто они квалифицируются как антигипоксанты (гипоксен, бемитил, амтизол, этомерзол, тримин), антиоксиданты (мексидол, препараты янтарной кислоты), психоэнергизаторы (тонибрал, яктон, ладастен). Нейропептиды применяются в клинической фармакологии сравнительно недавно. Среди них следует выделить органопрепараты (церебролизин, кортексин), малые концентрации антител к биологически значимым эндогенным субстанциям (пропротен-100, тенотен) и синтетические пептиды (семакс, селанк, дельтаран, алаптид, аргинин-вазопрессин, ноопепт, кортаген). Сравнительное изучение пептидных препаратов в эксперименте и клинических условиях показало их высокую нейропротективную активность (Шабанов П.Д., 2008, 2011). Пептиды оказались эффективными для устранения последствий длительной социальной изоляции, после активации систем стресса в раннем онтогенезе, при экспериментальной ишемии мозга (перевязка сонных артерий), после перенесенной черепно-мозговой травмы, при повышенной судорожной активности. В клинике кортексин, церебролизин, семакс и ноопепт были эффективны в постабстинентный период у больных алкоголизмом, у тяжелых соматических больных с астеническим синдромом, после перенесенных черепно-мозговых травм, у детей с судорожным синдромом, после отравления нейротропными ядами, для ускоренной акклиматизации при быстрых изменениях климатических условий среды (Востриков В.В. и др., 2006; Ганапольский В.П., 2008).

Степень разработанности темы исследования

В отечественной медицине, в частности в неврологии, имеется определенный крен в сторону использования зарубежных органопрепаратов, в особенности, церебролизина, который получают из цельного мозга. Это происходит в силу сложившихся исторических традиций, поскольку до 1990-х гг. в России отсутствовали собственные препараты аналогичного действия. В настоящее время такие препараты созданы и начали активно применяться. Речь идет об органопрепарате кортексине, его действующем начале кортагене (Ala-Glu-Asp-Pro), олигопептидах селанке, семаксе и дельтаране, воссозданных на основе природных аналогов, а также о синтетических пептидах ноопепте и дилепте (Шабанов П.Д. и др., 2006, 2011). Следует признать, что доказательных исследований об эффектах пептидных препаратов и их механизме действия до настоящего аремени явно недостаточно. Поэтому объективизированное исследование на животных всегда помогает разобраться, насколько эффективны препараты с фармакологической точки зрения, поскольку результаты исследования свидетельствуют о реальных последствиях применения препаратов.



Цель и задачи исследования

Целью исследования было сравнительное изучение эмоциогенных и нейропротективных эффектов 9 препаратов пептидной структуры (кортексин, церебролизин, дельтаран, кортаген, олеил-кортаген, семакс, селанк, ноопепт, дилепт) в опытах на крысах.

Задачи исследования:

1) Исследовать особенности влияния препаратов пептидной структуры (кортексин, церебролизин, дельтаран, кортаген, олеил-кортаген, семакс, селанк, ноопепт, дилепт) на двигательное и эмоциональное поведение половозрелых крыс в экспериментах по методикам: «открытое поле», «чужак-резидент» (тест агрессивности), приподнятый крестообразный лабиринт (тест тревожности), тест Порсолта (оценка депрессивности), самостимуляция латерального гипоталамуса (тест эффекта подкрепления).

2) Выяснить характер влияния препаратов пептидной структуры (кортексин, церебролизин, дельтаран, кортаген, олеил-кортаген, семакс, селанк, ноопепт, дилепт) на двигательное и эмоциональное поведение крыс, подвергнутых продолжительной алкоголизации в течение 3 месяцев.

3) Исследовать особенности влияния препаратов пептидной структуры (кортексин, кортаген) на обмен моноаминов в головном мозге крыс, подвергнутых продолжительной алкоголизации в течение 6 месяцев.



Научная новизна

Изучены и описаны особенности действия препаратов пептидной структуры (кортексин, церебролизин, дельтаран, кортаген, олеил-кортаген, семакс, селанк, ноопепт, дилепт) на двигательное и эмоциональное поведение крыс, оцененные на основе поведенческих тестов: «открытое поле» (двигательная и исследовательская активность), «чужак-резидент» (агрессивность), приподнятом крестообразном лабиринте (тревожность), тесте Порсолта (депрессивность), самостимуляции латерального гипоталамуса (подкрепляющие свойства). Психофармакологический анализ 9 пептидных препаратов в сравнении с действием пирацетама и мексидола показал, что выраженным активирующим действием на двигательные и исследовательские компоненты поведения в «открытом поле» обладают преимущественно церебролизин (1 мг/кг), олеил-кортаген (1 мг/кг) и пирацетам (200 мг/кг), при этом пирацетам и церебролизин повышают эмоциональность животных. Депримирующий тип действия выявлен у дилепта (1 мг/кг), снижавшего горизонтальную и вертикальную активность крыс. Антиагрессивное действие в тесте «интрудер-резидент» выявлено только у селанка (0,1 мг/кг). Ряд исследованных пептидов (олеил-кортаген, дилепт и кортексин) проявляет антидепрессантные свойства, тогда как церебролизин (1 мг/кг), семакс (0,1 мг/кг), кортаген (1 мг/кг) и селанк (0,1 мг/кг), напротив, депрессантную активность в тесте Порсолта. Отмечено, что, олеил-кортаген и кортексин активировали самостимуляцию латерального гипоталамуса. Следовательно, явные психоактивирующие свойства присущи церебролизину, олеил-кортагену, кортексину и пирацетаму, тогда как дилепт, селанк и в меньшей степени семакс способны несколько угнетать поведение крыс, проявляя депримирующий тип действия.

Длительная алкоголизация (3 мес) меняла эффекты пептидных препаратов и препаратов сравнения (пирацетам и мексидол) на поведение вплоть до их извращения. Типичными примерами такого действия служат изменение психоактивирующего действия пептидов на угнетающее в тесте «открытого поля», нормализация индивидуального поведения и общительности крыс, сниженных длительной алкоголизацией, и появление антидепрессантной активности у ряда пептидных препаратов (кортексин, церебролизин, дельтаран, дилепт, мексидол) только в условиях алкоголизации.

В биохимических исследованиях доказано, что хроническая полунасильственная алкоголизация умеренно замедляла обмен дофамина, но ускоряла обмен серотонина в структурах мезолимбической (прилежащее ядро, медиальная префронтальная кора) и нигростриатной (стриатум) систем головного мозга крыс. Пептидные препараты кортексин и в меньшей степени кортаген при системном и внутрижелудочковом введении восстанавливали обмен дофамина в исследованных эмоциогенных дофаминергических структурах головного мозга алкоголизированных крыс. В то же время оба пептида усиливали действие алкоголизации на серотонинергическую систему. Следовательно, положительные эффекты пептидов на нарушения поведения, вызванные длительной алкоголизацией, связаны с их действием на обмен моноаминов в мезолимбической и нигростриатной системах головного мозга крыс.



Научно-практическая значимость

Получены оригинальные данные об особенностях эмоциогенных и нейропротекторных свойств ряда новых отечественных препаратов пептидной структуры (ноопепт, дилепт, кортексин, кортаген, семакс, селанк, дельтаран, олеил-кортаген). Выявлены пептидные средства, наиболее активные в отношении защиты мозга от повреждающего действия длительной алкоголизации. Показано, что пептидные препараты восстанавливают индивидуальное поведение и общительность крыс, подвергнутых длительной алкоголизации, оказывают умеренное успокаивающее действие на животных, устраняют депрессивноподобное состояние, обусловленное длительным потреблением этанола. Сама хроническая полунасильственная алкоголизация умеренно замедляет обмен дофамина, но усиливает обмен серотонина в структурах мезолимбической (прилежащее ядро, медиальная префронтальная кора) и нигростриатной (стриатум) систем головного мозга крыс. На примере пептидных препаратов кортексина и кортагена показано, что они при системном и внутрижелудочковом введении ускоряют обмен дофамина в структурах мезолимбической и нигростриатной систем головного мозга крыс при их длительной алкоголизации, но усиливают действие алкоголизации на серотонинергическую систему. По-видимому, положительный эффект пептидных препаратов на поведение крыс при хронической алкоголизации связан именно с нормализацией обмена моноаминов (прежде всего дофамина) в эмоциогенных структурах головного мозга. Указанные свойства предполагают вероятность использования пептидных препаратов при поведенческих расстройствах адаптации, связанных со злоупотреблением алкоголем. Конкретно, к таким препаратам отностятся ноопепт, дилепт, кортексин и селанк. Полученные данные позволяют рекомендовать отмеченные препараты пациентам с эмоциональными и когнитивными нарушениями, и прежде всего, тем, у кого выявлена пограничная психиатрическая патология.



Методология и методы исследования

Методология исследования предусматривала изучение поведения крыс в батарее тестов на двигательную, исследовательскую активность и эмоциональность («открытое поле», приподнятый крестообразный лабиринт, «чужак-резидент», тест Порсолта), вживление электродов и канюль в структуры мозга и изучение подкрепляющих эффектов фармакологических агентов методом самостимиляции латерального гипоталамуса и биохимическое исследование обмена моноаминов (дофамин, норадреналин, серотонин) в эмоциогенных и двигательных структурах головного мозга. В качестве фармакологических агентов использовали девять пептидных препаратов в основном с ноотропным типом действия (кортексин, церебролизин, дельтаран, кортаген, олеил-кортаген, семакс, селанк, ноопепт) и два препарата сравнения (мексидол, пирацетам), которые вводили перед тестированием системно или в желудочки мозга. Исследования выполнены с соблюдением правил этического обращения с животными и принципов доказательной медицины.



Основные положения, выносимые на защиту:

1. Большинство исследованных пептидных препаратов (кортексин, церебролизин, дельтаран, кортаген, олеил-кортаген, семакс, селанк, ноопепт), за исключением дилепта, обладает ноотропным (психоактивирующим) типом действия.

2. Длительная алкоголизация крыс меняет типичные ноотропные эффекты пептидных препаратов.

3. Влияние пептидных препаратов и препаратов сравнения (пирацетам и мексидол) на поведение в условиях длительной алкоголизации характеризуется извращением фармакологических эффектов. Психоактивирующее действия пептидов при алкоголизации меняется на депримирующее; под влиянием пептидов нормализуется индивидуальное поведение и общительность крыс, сниженные вследствие длительной алкоголизацией; в условиях алкоголизации отмечен не свойственный пептидным препаратам (кортексину, церебролизину, дельтарану, дилепту, мексидолу) антидепрессантный эффект.

4. При хронической алкоголизации крыс замедляется обмен дофамина и усиливается обмен серотонина в структурах нигростриатной и мезолимбической систем мозга.

5. Антидепрессантное и психоактивирующее действие пептидных препаратов кортексина и кортагена характеризуется нормализацией обмена дофамина, а также неизменностью (или активизацией) обменных процессов серотонина в структурах нигростриатной и мезолимбической систем мозга.



Степень достоверности и апробация материалов исследования

Достоверность исследований определялась достаточным числом наблюдений, соблюдением правил доказательной медицины (выборка, рандомизация, наличие контролей) и корректной статистической обработкой полученных данных с помощью современных компьютерных программ.

Личный вклад автора. Автором самостоятельно спланировано исследование, намечен алгоритм его выполнения, выполнены все экспериментальные исследования на животных, проведена их статистическая обработка. Самостоятельно написана диссертация, сформулированы выводы и научно-практические рекомендации, подготовлен и оформлен автореферат диссертации.

Реализация результатов работы. Материалы исследования используются в лекционном курсе кафедры фармакологии и кафедры нормальной физиологии Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова. Работа выполнена в соответствии с плановыми научно-исследовательскими разработками Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова. Материал диссертации вошел в грантовые разработки Российского фонда фундаментальных исследований при РАН (РФФИ №07-04-00549а и №10-04-00473а).

Апробация и публикация материалов исследования. Материалы, вошедшие в диссертацию, доложены на Юбилейной Российской научной конференции, посвященной 175-летию С.П.Боткина (Санкт-Петербург, 2007), III съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), V Всероссийской научной конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 100-летию В.Н.Черниговского (Санкт-Петербург, 2007). По теме диссертации опубликованы 6 статей (4 в журналах, рекомендованных ВАК РФ) и 4 тезиса. Апробация диссертации прошла на совместном заседании кафедр фармакологии и нормальной физиологии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, главы с изложением материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований (включающей 3 раздела), обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 рисунками и 17 таблицами. Библиографический указатель содержит 204 наименований, в том числе 83 отечественных и 121 иностранных.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования

Выбор животных. Опыты выполнены на 596 крысах самцах и самках Вистар массой 200-250 г, выращенных в группе по 5 особей в стандартных пластмассовых клетках в условиях вивария. Животных содержали при свободном доступе к воде и пище в условиях инвертированного света 8.00-20.00 при температуре 22±2оС. Все опыты проведены в осенне-зимний период.

Вживление электродов в структуры мозга. Вживление электродов в мозг крысам проводили под нембуталовым наркозом (50 мг/кг) с использованием стереотаксического прибора фирмы «Medicor», Венгрия. Билатерально в латеральное гипоталамическое ядро вживляли нихромовые монополярные электроды в стеклянной изоляции (диаметр электрода 0,25 мм, длина оголенного кончика 0,25-0,30 мм, его толщина 0,12 мм) по следующим координатам: АР = 2,5 мм назад от брегмы, SD = 2,0 мм латерально от сагиттального шва, Н = 8,4 мм от поверхности черепа (König K.P., Klippel A.A., 1963). Индифферентный электрод из нихромовой проволоки закрепляли на черепе животного. Все электроды коммутировали на микроразъеме, который фиксировали на черепе самотвердеющей пластмассой. Поведенческие эксперименты начинали не ранее 10 дней после операции. По окончании всех опытов производили морфологический контроль локализации кончиков электродов на серии фронтальных срезов мозга, которые окрашивали по методу Ниссля, предварительно производили коагуляцию через вживленные электроды током силой 1 мА в течение 30 с.

Методы самораздражения мозга у крыс. Использовали классический вариант изучения самораздражения мозга в виде педальной самостимуляции в камере Скиннера. Через 10 дней после вживления электродов в мозг крыс обучали нажимать на педаль в камере Скиннера для получения электрического раздражения мозга (прямоугольные импульсы отрицательной полярности, длительностью 1 мс, с частотой 100 Гц, в течение 0,4 с, пороговые значения тока в режиме «фиксированных пачек»). Частоту и длительность нажатий регистрировали автоматически. Анализировали частоту и время каждого нажатия на педаль. На основании этих результатов вычисляли коэффициент «рассогласования» (Лебедев А.А., Шабанов П.Д., 1992). Коэффициент «рассогласования» является удобным показателем для оценки действия фармакологических препаратов. Последние вводили на 3-й день эксперимента после стабилизации реакции при использовании фиксированного значения силы тока. Регистрировали число нажатий на педаль и коэффициент «рассогласования» в течение 10 мин эксперимента, затем производили внутрибрюшинную инъекцию препарата, и через 30 мин регистрировали те же показатели (число нажатий на педаль и коэффициент «рассогласования») за 10-минутный интервал времени.

Исследование поведения крыс в «открытом поле». Свободную двигательную активность животных исследовали в тесте «открытого поля», представляющего собой круглую площадку диаметром 80 см, ограниченную по окружности непрозрачными бортами высотой 30 см. По всей площади открытого поля равномерно расположены 16 отверстий (норок), диаметром 3 см каждая, предназначенных для выявления видоспецифического компонента исследовательской активности у грызунов (норковый рефлекс). Освещенность открытого поля равнялась 100 лк. Во время опыта экспериментальный вольер находился в специальной звукоизолированной комнате. Продолжительность одного опыта составляла 3 мин. На основании поведенческого атласа для грызунов (Михеев В.В., Шабанов П.Д., 2007) выбирали ряд элементарных двигательных актов и поз, совокупность которых характеризует целостное поведение в «открытом поле».

Исследование поведения в тесте Порсолта на депрессивность. Плавательный тест «отчаяния» Порсолта (Porsolt R.D., 1977) предусматривает оценку двигательной активности крыс, помещенных в стеклянный цилиндр диаметром 20 см и высотой 40 см, на 1/3 заполненный водой с температурой 27±1оС. Животное помещают в цилиндр на 6 мин, регистрируют время активного и пассивного плавания и время иммобилизации. Увеличение активного плавания и уменьшение времени иммобилизации рассматривают как антидепрессантный эффект.

Исследования поведения крыс в приподнятом лабиринте. Поведение крыс в приподнятом лабиринте исследовали в установке, представлявшей крестообразный приподнятый лабиринт, который состоял из двух открытых рукавов 50х10 см и двух закрытых рукавов 50х10 см с отрытым верхом, расположенных перпендикулярно относительно друг друга. Высота над полом 1 м. Животное помещали в центр лабиринта. Путем нажатия соответствующей клавиши этографа, связанного с компьютером, фиксировали время пребывания в закрытых и открытых рукавах, время свешивания в отрытых рукавах и число выглядываний из закрытых рукавов. Продолжительность теста составляла 5 минут.

Изучение агрессии в тесте «чужак-резидент». Агрессивность изучали у половозрелых крыс самцов в тесте чужак-резидент в соответствии с описанием этологического атласа (Михеев В.В., Шабанов П.Д., 2007). Суть методики заключалась в том, что к крупному самцу, постоянно находящемуся в клетке (резиденту), подсаживали более мелкое животное (чужака). Регистрировали число поведенческих проявлений агрессивности и защиты, а также общее число поведенческих актов, характеризующих взаимоотношение двух особей крыс.

Процедура алкоголизации. Часть крыс (262 крысы) подвергали полунасильственной алкоголизации, когда 15%-ный раствор этанола являлся единственным источником жидкости при свободном доступе к брикетированному сухому корму. Продолжительность алкоголизации составляла 3-6 мес. Алкоголизацию начинали у крыс в возрасте не менее 90-100 дней. На период поведенческих экспериментов алкоголь не отменяли.

Фармакологические вещества, используемые для анализа двигательных и эмоциональных форм поведения. Для фармакологического анализа использовали 9 пептидных препаратов с ноотропным типом действия: кортексин (1 мг/кг), церебролизин (1 мг/кг), дельтаран (0,1 мг/кг), кортаген (1 мг/кг), олеил-кортаген (1 мг/кг), семакс (0,1 мг/кг), селанк (0,1 мг/кг), ноопепт (1 мг/кг), дилепт (1 мг/кг), которые вводили внутрибрюшинно за 30-40 мин до тестирования и оценки поведения. В качестве препаратов сравнения использовали ноотроп пирацетам (200 мг/кг) и антиоксидант с ноотропным типом действия мексидол (50 мг/кг). В опытах с внутрижелудочковым введением препаратов использовали кортексин и кортаген в дозе 0,1 мг/кг, которые вводили в боковой желудочек мозга в объеме 2 мкл. Контрольные животные получали инъекцию 0,9%-ного раствора хлорида натрия (физиологический раствор). Выбор доз фармакологических средств основывался на литературных данных и собственных наблюдениях (Островская Р.У., 2005; Воронина Т.А. и др., 2007; Шабанов П.Д. и др., 2008, 2010).

Определение содержания моноаминов и их метаболитов в структурах мозга методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией. При изучении влияния пептидных препаратов на содержание дофамина, серотонина и их метаболитов в структурах мозга крыс использовали хроматографическую систему, состоящую из насоса 305 Gilson, инжектора Rheodyne, колонки Partisil 5ODS3 (4,6 х 250,0 мм), предколонки Pellicular ODS (4,6 х 70,0 мм) и электрохимического детектора LC-4B BAS при потенциале +0,75В. детектора LC-4B BAS при потенциале +0,75В. Состав подвижной фазы: 0,025 М цитрат-фосфатного буфера (рН 3,7), 0,002 М Na2ЭДТА, 0,015% додецилсульфата натрия, 12,5% метанола. Объемная скорость потока растворителя поддерживалась на уровне 1 мл/мин. Время анализа стандартной смеси веществ при таких условиях не превышало 40 минут.

Из мозга крыс выделяли структуры головного мозга (навеска составляла 4,1-4,5 мг для подкорковых и стволовых структур и 7,5-8,5 мг для префронтальной коры) и замораживали в жидком азоте (после внутрижелудочкового введения – через 40 мин). Ткань мозга хранили в холодильнике при –70оС до последующего анализа. Перед анализом пробы гомогенизировали, центрифугировали в течение 5 мин при 5000 об/мин с добавлением 50 мкл хлорной кислоты (0,1 М).



с. 1 с. 2 с. 3 с. 4