Стеценко владимир Петрович индивидуальная чувствительность крыс к

с. 1 с. 2 с. 3 с. 4


На правах рукописи
СТЕЦЕНКО

Владимир Петрович

ИНДИВИДУАЛЬНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КРЫС

К НЕЙРОПЕПТИДАМ И НООТРОПАМ ПОСЛЕ МОДУЛЯЦИИ СИСТЕМ СТРЕССА И АНТИСТРЕССА В РАННЕМ ОНТОГЕНЕЗЕ
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология

03.03.01 – физиология


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург

2013


Работа выполнена в Федеральном казенном военном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Военно-медицинская
академия им. С.М. Кирова» МО РФ
Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Шабанов Петр Дмитриевич,

доктор биологических наук профессор Лебедев Андрей Андреевич
Официальные оппоненты:

Ганапольский Вячеслав Павлович, доктор медицинских наук,

ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ,

начальник отдела обитаемости Научно-исследовательского центра
Якимовский Андрей Федорович, доктор медицинских наук, профессор,

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» МЗ РФ, заведующий кафедрой нормальной


физиологии

Ведущее учреждение:

ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский

университет им. И.И. Мечникова» МЗ РФ
Защита состоится 25 июня 2013 года в 13.00 часов на заседании
диссертационного совета Д 215.002.07 на базе ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ

(194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д.6).


С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ.
Автореферат разослан «____» мая 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор
Борис Николаевич Богомолов
ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Концепция стресса, описывающая реакцию гипофизарно-надпочечнико­вой системы на действие факторов внешней и внутрен­ней среды, сформулированная канадским исследователем Г. Селье еще в 1930-е гг., до настоящего времени не устарела в основных ее прояв­лениях. Она была существенно дополнена в 1950-е гг., когда были от­крыты, описаны и изучены пептидные гормоны гипофиза и гипоталамуса (рилизинг-гормоны), однако принципиальных изменений не претерпела (Шаляпина В.Г., Ракицкая В.В., 2003; Шаляпина В.Г., Шабанов П.Д., 2005).

Кортикотропинрилизинг-гормону (КРГ), или кортиколиберину отводят роль центрального регулятора стресса, запускающего каскад гормональных и вегетативных реакций, участвующих в адаптации (Судаков К.В., 2010). С другой стороны, были открыты и изучены белки теплового шока (БТШ), по мнению большинства исследователей (Андреева Л.И. и др., 2005; Маргулис Б.А., Гужова И.В., 2009), выполняющие роль антистрессорных агентов. БТШ вырабатываются в ответ на разные экстремальные воздействия среды и выполняют роль внутриклеточных шаперонов (Andreeva L.I. et al., 2004). Наиболее изучены БТШ с молекулярной массой 70 кДа (БТШ-70), представленные стабильной и индуцибельной формами, которые по-разному реагируют на внешние факторы среды. По сути, стрессорный ответ стали рассматривать как системный ответ организма, опосредованный действием гормональных факторов на исполнительные органы, в которых, в свою очередь, запускаются и антистрессорные системы (системы внутриклеточных шаперонов). Центральным органом системы стресса-антистресса является головной мозг. Любые внешние воздействия на эту систему существенно не меняют функционального значения отдельных образований системы гипоталамус → гипофиз → надпочечники → гипофиз (гипоталамус), но вся система может функционировать с большим или меньшим напряжением в зависимости от действия на нее стрессогенных факторов и их выраженности (силы).

Открытие внегипоталамической системы КРГ, локализованной главным образом в миндалине и гиппокампе (Alheid G.F., Heimer L., 1996; Шабанов П.Д. с соавт., 2006; Шабанов П.Д., Лебедев А.А., 2007; Shabanov P.D., 2008; Shabanov P.D., Lebedev A.A., 2008), поставило ряд важных вопросов, в том числе: каково функциональное значение этих экстрагипоталамических рецепторов КРГ, сходно ли оно с функцией гипоталамических рецепторов и если нет, в какой степени они вовлекаются в реализацию центральных механизмов стресса, каково их значение в онтогенетическом развитии особи и, наконец, насколько они могут определять эффекты фармакологических веществ центрального действия?




Степень разработанности темы

Несмотря на явные успехи в выяснении многих вопросов, затрагивающих механизмы реализации стрессорного ответа и включения системы стресса-антистресса (стресс-активирующей и стресс-лимитирующей систем по терминологии М.Г. Пшенниковой, 2000), значительная часть из них остается недостаточно изученной (Угрюмов М.В., 2012). Это касается, прежде всего, выяснения внутримозговых механизмов формирования реакции на стресс, ее нейромедиаторных, гормональных и нейропептидных компонентов, формирования стрессорной реакции в онтогенезе и ее нейрохимического обеспечения, наконец, возможностей управления стрессорной реакцией с помощью фармакологических средств.


Цель и задачи исследования

Целью исследования явилось изучение индивидуальной чувствительности самцов и самок крыс к нейропептидам после модуляции систем стресса и антистресса в раннем онтогенезе.

В задачи исследования входило:

1. Оценить поведенческие последствия у половозрелых самцов и самок крыс после модуляции систем стресса и антистресса в раннем онтогенезе (7-е сутки постнатального периода);

2. Оценить морфологические изменения в надпочечниках и эмоциогенных структурах мозга половозрелых крыс после модуляции систем стресса и антистресса в раннем онтогенезе;

3. Оценить поведенческие эффекты пептидных препаратов (ноопепта, дилепта и кортексина) у половозрелых самцов и самок крыс после модуляции систем стресса и антистресса в раннем онтогенезе.
Научная новизна

В работе обоснован научный тезис, что модуляция систем стресса-антистресса в раннем онтогенезе приводит к развитию у половозрелых животных девиантных форм поведения, заключающихся в изменении двигательных, исследовательских и эмоциональных компонентов поведения, а также индивидуальной чувствительности животных к действию пептидных препаратов ноотропного типа действия. В основе измененной реактивности организма лежат постстрессорные перестройки в эмоциогенных структурах мозга, отличающиеся в зависимости от природы вводимого стрессогена. К ним относятся избирательные дистрофические изменения в дофаминергических структурах головного мозга (прежде всего, в вентральной области покрышки, дающей начало медиальному переднемозговому дофаминергическому пучку, иннервирующему лимбические структуры мозга). Последствия дистрофических процессов в нейроглиальных комплексах эмоциогенных структур проявляются изменением поведенческих эффектов пептидных препаратов (ноопепта, дилепта и кортексина), зависимых от пола животного. Трансформация ноотропных эффектов в большей степени касается эмоциональных реакций, которые могут меняться на противоположные (анксиолитический эффект на анксиогенный, антидепрессантный на депрессантный, и наоборот). Указанные изменения необходимо учитывать при оценке индивидуальной чувствительности к фармакологическим средствам вообще, и ноотропным препаратам, в частности.


Теоретическая и практическая значимость

Теоретическое значение работы состоит в доказательстве научного положения, что индивидуальная чувствительность к фармакологическим средствам ноотропного типа действия во многом определяется особенностями развития организма в раннем онтогенезе, включая даже однократные (!) стрессогенные воздействия. Последствия таких воздействий реализуются в программе развития субъекта и могут проявляться в половозрелом возрасте отклонениями (девиациями) исследовательской активности, двигательными нарушениями (по типу гиперкинетических), но, самое главное, эмоциональным реагированием на факторы окружающей среды, включая лекарственные средства. В условиях применения, например, ноотропных средств, предназначенных для восстановительных и реабилитационных целей у здоровых и больных субъектов, реактивность (индивидуальная чувствительность) может меняться, трансформируя биологический ответ из анксиолитической формы в анксиогенную, из антидепрессантной в депрессантную. Такая реактивность зависит также от половой конституции субъекта, причем имеются выраженные гендерные различия в индивидуальной чувствительности. Эти различия определяются сформировавшимися изменениями в эмоциогенных структурах головного мозга в процессе онтогенеза. Наконец, полученные данные доказывают необходимость проведения исследований по оценке действия лекарственных препаратов не только на самцах животных (как принято во всех странах мира), но и на самках, поскольку поведенческие эффекты у животных разного пола существенно отличаются друг от друга, часто трансформируясь в противоположные по знаку. В этом заключается практическая значимость настоящего исследования.


Методология и методы исследования

Методология исследования состояла в изучении поведенческих последствий у половозрелых самцов и самок крыс (389 крысят и половозрелых животных) после модуляции систем стресса (введение КРГ) и антистресса (введение БТШ-70) в раннем онтогенезе (7-е сутки постнатального периода) с помощью батареи тестов («открытое поле», приподнятый крестообразный лабиринт, ротационный тест, «чужак-резидент», тест Порсолта), морфологическом изучении изменений в надпочечниках и эмоциогенных структурах мозга половозрелых крыс после модуляции систем стресса и оценки поведенческих эффектов пептидных препаратов (ноопепта, дилепта и кортексина) у половозрелых самцов и самок крыс после модуляции систем стресса и антистресса в раннем онтогенезе (7-е сутки постнатального периода). Исследования выполнены с соблюдением всех принципов доказательной медицины и одобрены локальным комитетом по этике при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ.


Положения, выносимые на защиту:

  1. Модуляция систем стресса-антистресса в раннем онтогенезе однократным введением КРГ или БТШ-70 изменяет эмоциональное и двигательное поведение половозрелых животных, морфологию эмоциогенных структур головного мозга и эффекты пептидных препаратов ноотропного типа действия;

  2. Существуют гендерные различия в отсроченных эффектах модуляции систем стресса-антистресса в раннем онтогенезе. У самцов эти различия сводятся к изменению, прежде всего, двигательных форм поведения, у самок – эмоциональных и исследовательских форм поведения;

  3. Ноотропные препараты пептидной природы (ноопепт, дилепт, кортексин) после модуляции систем стресса-антистресса в раннем онтогенезе выявляют индивидуальную чувствительность, наиболее выраженную при оценке противотревожных и антидепрессантных эффектов препаратов;

4. Индивидуальная чувствительность ноотропных препаратов пептидной природы (ноопепт, дилепт, кортексин) после модуляции систем стресса-антистресса в раннем онтогенезе связана с морфологическими перестройками в эмоциогенных структурах головного мозга крыс (черная субстанция, вентральная область покрышки, подлимбическое поле, поясные поля).
Степень достоверности и апробация результатов исследования

Достоверность определяется большим количеством экспериментальных животных (389 крыс), рандомизацией и формированием групп сравнения и активного контроля, адекватными поведенческими, токсикологическими, морфологическими, биохимическими и фармакологическими методами исследования, длительными сроками наблюдения и корректными методами статистической обработки.

Материалы исследования используются в лекционном курсе кафедр фармакологии и нормальной физиологии Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова, кафедры психиатрии и наркологии Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, кафедры нервных болезней и психиатрии Института медицинского образования Новгородского государственного университета им. Ярослава Мудрого. Работа выполнена в соответствии с плановыми научно-исследовательскими разработками Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. Материал диссертации вошел в грантовые разработки Российского фонда фундаментальных исследований при РАН (РФФИ №07-04-00549 и №10-04-00473).

Материалы диссертации доложены на XX съезде Всероссийского физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007), Х научной конференции «Нейроиммунология-2007» (Санкт-Петербург, 2007), V Всероссийской научной конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 100-летию В.Н. Черниговского (Санкт-Петербург, 2007), III съезде Российского научного общества фармакологов (Санкт-Петербург, 2007), международной конференции «Новые технологии в медицине и экспериментальной биологии» (Рио-де-Жанейро, Бразилия, 2011), международной конференции «Экспериментальная и клиническая фармакология» (Гродно, 2011). По теме диссертации опубликованы 14 научных работ (8 статей и 6 тезисов), из них 3 статьи в журналах списка, рекомендованных ВАК РФ. Апробация диссертации прошла на совместном заседании кафедр фармакологии и нормальной физиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова.



Личный вклад автора. Личный вклад автора осуществлялся на всех эта-пах работы и состоял в планировании опытов, их непосредственном выполне-нии, обработке полученных результатов, обсуждении результатов, написании статей и тезисов, написании диссертации и автореферата. Участие автора в вы-полнении, сборе и анализе – 95%, статистической обработке – 100%, в написа-нии статей и тезисов – 90%, написании диссертации и автореферата – 95%.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований (включающей 3 раздела), обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 рисунками и 31 таблицей. Библиографический указатель содержит 193 наименования, в том числе 84 отечественных и 109 иностранных.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 представляет собой обзор литературы и описывает современные представления о нейрохимических механизмах стресса и их становлении в онтогенезе.

Глава 2 включает описание основных методических приемов, которые были использованы при выполнении диссертации.

Глава 3 объединяет результаты собственных исследований автора.

Глава 4 представляет собой обсуждение полученных результатов.

В заключении обобщены основные перспективы исследования, приведены выводы, научно-практические рекомендации и список использованных литературных источников.



МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выбор животных. Опыты выполнены на 389 крысах Вистар массой 200-220 г, выращенных в группе по 5 особей в стандартных пластмассовых клетках в условиях вивария. Крысятам в возрасте 7 дней внутрибрюшинно однократно вводили 0,5 мкг/крысу КРГ (Sigma, США) или 5 мкг/крысу БТШ-70 (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Животных содержали в однополых группах в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище в условиях инвертированного света 8.00-20.00 при температуре 22±2оС. Все поведенческие опыты проводили на половозрелых животных в возрасте 90-100 дней в осенне-зимний период. После проведения всех поведенческих опытов животных декапитировали, извлекали надпочечники и мозг и готовили гистологические препараты.

Исследование поведения крыс в «открытом поле». Свободную двигательную активность животных исследовали в тесте «открытого поля» (Михеев В.В., Шабанов П.Д., 2007), представляющего собой круглую площадку диаметром 80 см с 16 отверстиями (норками) диаметром 3 см каждая. Продолжительность одного опыта составляла 3 мин. Регистрировали ряд элементарных двигательных актов и поз: горизонтальную и вертикальную активность, груминг, заглядывание в норки, дефекацию.

Исследование поведения в приподнятом крестообразном лабиринте. Лабиринт состоял из двух открытых рукавов 50х10 см и двух закрытых рукавов 50х10 см с отрытым верхом, расположенных перпендикулярно относительно друг друга. Высота над полом 1 м. Животное помещали в центр лабиринта. Путем нажатия соответствующей клавиши этографа, связанного с компьютером, фиксировали время пребывания в закрытых и открытых рукавах, время свешивания в отрытых рукавах и выглядывания из закрытых рукавов. Продолжительность теста составляла 5 мин.

Исследование агрессии в тесте «чужак-резидент». Агрессивность изучали у половозрелых крыс самцов в тесте «чужак-резидент» в соответствии с описанием этологического атласа (Михеев В.В., Шабанов П.Д., 2007). Смысл методики состоит в том, что к крупному самцу, находящемуся в клетке (резиденту), подсаживают более мелкое животное (чужака). Регистрировали число поведенческих проявлений агрессивности и защиты, а также общее число поведенческих актов, описывающих взаимоотношение двух особей крыс.

Исследование антидепрессантной активности в тесте Порсолта. Плавательный тест «отчаяния» Порсолта (Porsolt R.D., Bertin A., 1977) предусматривает оценку двигательной активности крыс, помещенных в стеклянный цилиндр диаметром 20 см и высотой 40 см, на 1/3 заполненный водой с температурой 27±1оС. Крысу помещали в цилиндр на 6 мин, регистрировали время активного и пассивного плавания и время иммобилизации. Увеличение активного плавания и уменьшение времени иммобилизации расценивали как антидепрессантный эффект.

Морфологические исследования. Надпочечники и головной мозг крыс в возрасте 3,5-4 мес. через 3 мин после декапитации фиксировали в 9%-ном растворе нейтрального формалина, проводили через спирты и заливали в парафин по стандартной методике. Производили ленточные серийные срезы головного мозга во фронтальной плоскости от лобного полюса правого полушария до рострального отдела моста. Шаг лезвия бритвы составлял 8 мкм, для последующей съемки на CCD Camera (320 КРixel) через микроскоп Laboval – 5 мкм. Срезы в гистологических микропрепаратах окрашивали гематоксилином-эозином и по Нисслю. Составление блоков иллюстраций производили с помощью системы Microsoft Windows XP (Дробленков А.В., 2006).

Фармакологические вещества для анализа. Для анализа двигательных и эмоциональных форм поведения использовали отечественные синтетические пептиды ноопепт и дилепт (НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, Москва), а также органопрепарат кортексин (ЗАО «Герофарм», Санкт-Петербург), которые вводили половозрелым крысам в дозе 1 мг/кг внутрибрюшинно за 40 мин до тестирования перед каждым поведенческим тестом.

Статистическая обработка полученных материалов. Выборка для каждой группы животных составила не менее 10-12 крыс. Результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента, непараметрического критерия U Вилкоксона-Манна-Уитни, однофакторного дисперсионного анализа с последующим множественным межгрупповым сравнением по критерию Ньюмана-Кейлса.
с. 1 с. 2 с. 3 с. 4